Figure 2:Fungal
metagenomics sequencing with the ITS Metagenomics Workflow–The ITS Metagenomics Workflow is part of an integrated NGS workflow that includes library
preparation of the ITS1 amplicon, robust Illumina sequencing, anduser-friendly data analys is with the BaseSpace™ITS Metagenomics App. |
|
Kluczowe elementy tego
rozwiązania to : |
|
- Amplifikacja regionów ITS.
|
|
Regiony amplifikowane w
przedstawianej procedurze zlokalizowane są w obrębie sekwencji hiperzmiennych ITS1 (pomiędzy genami 18S oraz 5.8S rRNA ). Zaletą tego rozwiązania jest
duża elastyczność w kwestii stosowania primerów. Jak dokładniej to działa? Po pierwsze użytkownicy mogą wykorzystać sekwencje specyficzne dla starterów
zaprezentowane w protokole lub/oraz, na podstawie własnego doświadczenia lub w oparciu o informacje z publikacji zastosować primery o innych sekwencjach
np. komplementarnych nie tylko z ITS1 ale także ITS2. Jedynym warunkiem jest zaprojektowanie oligonukleotydów w taki sposób, aby sekwencja specyficzna
starterów została dodatkowo wzbogacona o uniwersalne sekwencje adapterowe umożliwiające przeprowadzenie dalszych etapów procedury. W tym układzie syntezę
oligonukleotydów należy zamówić we własnym zakresie (u dostawcy oferującego takie usługi) W przypadku starterów testowanych przez Illuminę, informacje o
sekwencjach specyficznych oraz adapterowych można znaleźć w przewodniku. |
|
- Inkorporacja indeksów pozwalających na multipleksację.
|
|
Kolejną zaletą tego
narzędzia jest minimalistyczne podejście do kompletowania i inwestowania w dodatkowe urządzania i odczynniki. Etap indeksowania bibliotek oparty jest o
reakcję PCR, do której potrzebujemy standardowych komponentów(mix PCR) oraz indeksów z serii Nextera XT v2 lub Nextera Cd Indexes. Umożliwiają one
kombinację odpowiednio do 384 lub do 96 próbek w jednym sekwencjonowaniu. W efekcie otrzymujemy podwójnie zindeksowane biblioteki ( z indeksami i5 oraz
i7) co, po pierwsze, gwarantuje właściwą demultipleksację, a po drugie, przyczynia się do redukcji kosztów przeprowadzanej analizy w przeliczeniu na jedną
próbkę. |
|
|
|
Odpowiednią skalę
rozdzielczości tego typu procedury zapewnia zoptymalizowana konfiguracja sekwenatora z odczynnikami generującymi odczyty o wymaganej długości . Może to
być np. sekwenator iSeq lub MiSeq, z zestawem do sekwencjonowania 2 x150 cykli. Rekomendowana liczba odczytów mieści się w zakresie od 15 tysięcy do 100
tysięcy w przeliczeniu na jedną próbkę, co stanowi główną determinantę maksymalnej liczby prób dla danego sekwenatora podczas jednej reakcji
sekwencjonowania. |
|
- Analiza z wykorzystaniem dedykowanej aplikacji.
|
|
BaseSpace ITS
Metagenomics App to oprogramowanie eliminujące potrzebę zagłębiania się w skomplikowane narzędzia bioinformatyczne. Istotą analizy jest przyrównanie
otrzymanych odczytów po sekwencjonowaniu do bazy referencyjnej UNITE. Klasyfikacja i kompozycja poszczególnych gatunków przedstawiana jest w postaci
różnego rodzaju wykresów czy dendrogramów. Wszystko po to, aby analiza metagenomiczna była prosta i szybka, a przedstawiane wyniki czytelne. |
|
Więcej informacji : |
|
https://emea.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/ documents/products/appnotes/its-metagenomics-app-note -1270-2018-001-web.pdf
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/ documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide- 1000000041074-05.pdf
|