Analiza i klasyfikacja grzybów z wykorzystaniem ITS
Nowy protokół do analizy ITS.
Mikobiom to grzybowa komponenta mikrobiomu i wbrew pozorom odgrywająca ważną rolę w wielu procesach biologicznych, chociażby w kontekście symbiozy, dekompozycji czy także progresji niektórych chorób. Głębsze poznanie tych procesów i występujących zależności może zostać osiągnięte dzięki dokładniejszemu zrozumieniu udziału poszczególnych komponentów tej „układanki”. Aby umożliwić naukowcom eksplorację tego tematu, Illumina przygotowała dedykowane narzędzie, którego głównym założeniem jest szybka i prosta identyfikacja bioty grzybów w próbkach reprezentujących różne środowiska (np. pobranych ze śliny, skóry, gleby, wody czy kału) bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowych.
Figure 2:Fungal metagenomics sequencing with the ITS Metagenomics Workflow–The ITS Metagenomics Workflow is part of an integrated NGS workflow that includes library preparation of the ITS1 amplicon, robust Illumina sequencing, anduser-friendly data analys is with the BaseSpace™ITS Metagenomics App.
Kluczowe elementy tego rozwiązania to :
  • Amplifikacja regionów ITS.
Regiony amplifikowane w przedstawianej procedurze zlokalizowane są w obrębie sekwencji hiperzmiennych ITS1 (pomiędzy genami 18S oraz 5.8S rRNA ). Zaletą tego rozwiązania jest duża elastyczność w kwestii stosowania primerów. Jak dokładniej to działa? Po pierwsze użytkownicy mogą wykorzystać sekwencje specyficzne dla starterów zaprezentowane w protokole lub/oraz, na podstawie własnego doświadczenia lub w oparciu o informacje z publikacji zastosować primery o innych sekwencjach np. komplementarnych nie tylko z ITS1 ale także ITS2. Jedynym warunkiem jest zaprojektowanie oligonukleotydów w taki sposób, aby sekwencja specyficzna starterów została dodatkowo wzbogacona o uniwersalne sekwencje adapterowe umożliwiające przeprowadzenie dalszych etapów procedury. W tym układzie syntezę oligonukleotydów należy zamówić we własnym zakresie (u dostawcy oferującego takie usługi) W przypadku starterów testowanych przez Illuminę, informacje o sekwencjach specyficznych oraz adapterowych można znaleźć w przewodniku.
  • Inkorporacja indeksów pozwalających na multipleksację.
Kolejną zaletą tego narzędzia jest minimalistyczne podejście do kompletowania i inwestowania w dodatkowe urządzania i odczynniki. Etap indeksowania bibliotek oparty jest o reakcję PCR, do której potrzebujemy standardowych komponentów(mix PCR) oraz indeksów z serii Nextera XT v2 lub Nextera Cd Indexes. Umożliwiają one kombinację odpowiednio do 384 lub do 96 próbek w jednym sekwencjonowaniu. W efekcie otrzymujemy podwójnie zindeksowane biblioteki ( z indeksami i5 oraz i7) co, po pierwsze, gwarantuje właściwą demultipleksację, a po drugie, przyczynia się do redukcji kosztów przeprowadzanej analizy w przeliczeniu na jedną próbkę.
  • Sekwencjonowanie.
Odpowiednią skalę rozdzielczości tego typu procedury zapewnia zoptymalizowana konfiguracja sekwenatora z odczynnikami generującymi odczyty o wymaganej długości . Może to być np. sekwenator iSeq lub MiSeq, z zestawem do sekwencjonowania 2 x150 cykli. Rekomendowana liczba odczytów mieści się w zakresie od 15 tysięcy do 100 tysięcy w przeliczeniu na jedną próbkę, co stanowi główną determinantę maksymalnej liczby prób dla danego sekwenatora podczas jednej reakcji sekwencjonowania.
  • Analiza z wykorzystaniem dedykowanej aplikacji.
BaseSpace ITS Metagenomics App to oprogramowanie eliminujące potrzebę zagłębiania się w skomplikowane narzędzia bioinformatyczne. Istotą analizy jest przyrównanie otrzymanych odczytów po sekwencjonowaniu do bazy referencyjnej UNITE. Klasyfikacja i kompozycja poszczególnych gatunków przedstawiana jest w postaci różnego rodzaju wykresów czy dendrogramów. Wszystko po to, aby analiza metagenomiczna była prosta i szybka, a przedstawiane wyniki czytelne.
Więcej informacji :

https://emea.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/
documents/products/appnotes/its-metagenomics-app-note
-1270-2018-001-web.pdf

https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/
documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-
1000000041074-05.pdf

Adres:

Analityk Genetyka sp. z o.o. sp.k.

Żwirki i Wigury 101

02-089 Warszawa

tel.: +48 22 552 67 16

fax: +48 22 552 67 30

tel. aplikacje: +48 22 299 50 30

www.analitykgenetyka.pl

biuro@analitykgenetyka.pl